RNA RT qPCR

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Trizol 法抽提RNA

1. 样品处理

（1）.培养细胞：收获长满的6cm dish 的细胞，吸去培液，用PBS轻轻冲洗两遍，去除残留的培液，吸尽PBS，往6cm dish 中加入1ml trizol 轻微震荡或用移液器吹打使细胞充分裂解。

（2）.肝组织：取绿豆大小的肝组织，用酒精消毒过的剪刀剪碎，放入已经加有1ml trizol 的匀浆管中，同时向管中加入4颗匀浆用磁珠，盖好匀浆管。匀浆机按5000转30S停顿30S再接着5000转30S的程序匀浆，匀浆完成后置于冰上。 2.加入0.2ml 氯仿，震荡15s，冰水放置2min；

3.4度12000g 离心15min，取上清；（切勿把中间白色的蛋白层连同上清一起吸入移液枪）

4.往步骤3中吸取的上清中加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，-40度冰箱放置30min以上；

5.4度12000g离心10min，弃上清；

6.往步骤5的沉淀中加入1ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀，4度7500g 离心5min，吸去上清；

7.晾干（时间不要过长，以免RNA发生降解），加入适量（一般为50-150ul）DEPC水溶解RNA。（可以65度促溶10-15min）

8.利用分光光度计测定RNA浓度和OD260/280数值。


RT（反转录）promega m-MLV 酶催化反转录体系（以50ul为例） RNA：2-5ug 5 X Buffer：10ul

dNTP（10mM for each）：2ul oligo（dT）(0.5ug/ul):1ul m-MLV:2ul

RNA酶抑制剂（RI）：1ul DEPC 水：补足50ul

上述体系配好以后，轻轻混匀，然后置于42度水浴锅水浴1h，RT反应即完成，可用于qPCR实验。

在进行qPCR实验之前，最好取0.5ulRT产物先用普通PCR 25个循环扩增actin，如果25个循环扩增actin条带还不是很清晰的话，那么说明产物cDNA浓度较低，不适宜用于qPCR定量。

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