茯苓三萜类化合物对酪氨酸酶的抑制作用

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茯苓三萜类化合物对酪氨酸酶的抑制作用

作者：陈怡，梁伟，郑思琦，王丽云，杨彤，李瑞 来源：《新经济》 2016年第5期



陈 怡 梁 伟 郑思琦 王丽云 杨 彤 李 瑞

摘 要：本文通过考察茯苓三萜提取物对酪氨酸酶活性的影响来确认茯苓三萜类化合物对酪氨酸酶是否起到抑制作用。

关键词：酪氨酸酶 茯苓 三萜类化合物 L-酪氨酸

基金项目：哈尔滨商业大学大学生创新创业训练计划项目，项目编号：201410240157。



茯苓是中药“四君八珍”其中之一。其味甘、性平，入药具有利水渗湿，健脾化痰，宁心安神的功效。可通过提取的茯苓三萜有效成分与酪氨酸酶液反应，通过测定吸光值进行比较判定茯苓三萜类化合物是否对酪氨酸酶具有抑制作用。观察了解茯苓三萜类化合物是否可以治疗黄褐斑，达到美白效果。

1、茯苓三萜类化合物的制备

将茯苓研制成粗粉，取茯苓生药粗粉20g放入圆底烧瓶中，向其中加入120ml的95%乙醇进行加热回流1.5h，冷却后过滤，再向滤渣中加入80ml95%乙醇，继续回流1.5h，冷却过滤合并滤液，置旋转蒸发仪中回收乙醇成稠膏状，称量后置4℃冰箱保存。

1.1 试剂配制

1.1.1 磷酸钠缓冲液(1/15 mol?L-1，pH=6.8)。精确称取磷酸二氢钠1.000g，磷酸氢二钠1.186g，加入少量蒸馏水溶解后，定容至500 mL容量瓶中，放在4℃冰箱保存备用。

1.1.2 L-酪氨酸溶液。精确称取L-酪氨酸0.272g，加入数滴浓盐酸后，再加入50 mL的蒸馏水，将其微热至完全溶解，用氢氧化钠溶液调pH至7左右，最后加蒸馏水定容至200mL。

1.1.3 受试液。精确称取茯苓提取物0.1g，加入20 mL蒸馏水使其溶解，得到5 mg?mL-1的待测液，再将其浓度对倍稀释到2.5 mg?mL-1、1.25 mg?mL-1、0.625 mg?mL-1、0.3125 mg?mL-1。

1.1.4 阳性对照(+CK)。精确称取熊果苷粉末0.1 g，溶于20mL的蒸馏水中，得到5mg?mL-1的阳性对照母液，再将其浓度对倍稀释到2.5mg?mL-1、1.25 mg?mL-1、0.625mg?mL-1、0.3125mg?mL-1。

2、酪氨酸酶液的制备

用新鲜完好的马铃薯制备酪氨酸酶液。具体操作为：将马铃薯洗干净，在4℃下预冷4h左右后去皮，将其切成约1.0 cm3丁状，放在-20℃下冷冻过夜。将其称重，按1：1( W:V )的比例加入4℃预冷的磷酸钠缓冲液，用组织捣碎机将其制成匀浆，并用3层纱布过滤，将滤液于4000 r/min离心10 min后得到的上清液即为所得的酪氨酸酶粗酶液，将其放在4℃下保存，务必在2h内用完。




3、检测方法

总反应体系为5mL。在此体系中，受试液、阳性对照熊果苷的终浓度(mg?mL-1)梯度均为0.03l25、0.0625、0.125、0.25、0.5。实验时，向试管中依次加入指定剂量的磷酸钠缓冲液、不同浓度梯度的茯苓受试液(包括阳性对照熊果苷)、酪氨酸酶液，于温度30℃下水浴10 min。然后向试管中加入底物L-酪氨酸，立即开始计时。反应时间20 min后在475 nm波长下测定吸光度值。测定时，以相应的阴性对照做参比，“受试液”、“标准对照”、“阳性对照”分别以“阴性对照1”、“阴性对照2”、“阴性对照3”调零。

用下列公式计算茯苓三萜受试液(包括阳性对照)对酪氨酸酶活性的抑制率，并跟据浓度—酶抑制率曲线估计半数抑制浓度(IC50)的近似值。

抑制率=[(A-B)/A]×l00%。

其中：“A”为标准对照的吸光值，“B”为受试液(或阳性对照)的吸光值。每个实验做3个平行。抑制率高表明其对酪氨酸酶活性的抑制强度就越高。

4、实验结果

4.1实验数据。本次实验测得的各个浓度的茯苓三萜受试液、标准对照液与熊果苷阳性对照液在475nm处的吸光度值见表2-4。







表中数据为各个浓度的受试液、标准对照、阳性对照熊果苷测得三组吸光度的平均值，可以根据吸光度值计算出茯苓三萜对酪氨酸酶的抑制率。

4.2 茯苓三萜对酪氨酸酶的抑制率。通过抑制率公式最终得到的各个浓度的茯苓三萜提取物与熊果苷对酪氨酸酶的抑制率。由数据可知，茯苓三萜与熊果苷对酪氨酸酶的抑制作用均随着浓度的增加而逐渐增强。并且茯苓三萜对酪氨酸酶的抑制强度要强于熊果苷对酪氨酸酶的抑制强度。

4.3 抑制率曲线

4.3.1 茯苓三萜的浓度-抑制率曲线通过研究茯苓三萜类化合物对酪氨酸酶活性的抑制作用，得到了茯苓三萜对酪氨酸酶活性抑制的曲线。可知，茯苓三萜类化合物对酪氨酸酶具有抑制作用，且抑制作用随着浓度的增加而逐渐增强，最后随着浓度的增加而增长缓慢。

4.3.2 二者的抑制率曲线比较通过研究茯苓三萜类化合物对酪氨酸酶活性的抑制作用，得到了茯苓三萜与阳性对照熊果苷对酪氨酸酶活性抑制的曲线。通过绘制茯苓三萜类化合物与熊


果苷对酪氨酸酶的抑制率曲线，可知茯苓三萜与阳性对照熊果苷对酪氨酸酶的抑制作用均随着浓度的增加而逐渐增强。对比可知，茯苓三萜类化合物对酪氨酸酶的抑制作用强于熊果苷对酪氨酸酶的抑制作用。由此可知，茯苓三萜类化合物可以通过抑制酪氨酸酶的活性来治疗黄褐斑，达到增白美容的效果。

4.4 茯苓三萜的IC50值。通过绘制茯苓三萜与熊果苷各个浓度对酪氨酸酶抑制率的曲线可知：茯苓三萜对酪氨酸酶活性抑制的回归方程为Y=0.5570x+0.0991，R2=0.8381；阳性对照熊果苷为Y=0.6771x+0.0159，R2=0.9436。通过回归方程可计算茯苓三萜与熊果苷的IC50值。

可知，茯苓三萜的半数抑制浓度IC50值为0.7197mg?mL-1；熊果苷的半数抑制浓度IC50为0.7250mg?mL-1。茯苓三萜的半数抑制浓度要小于熊果苷的半数抑制浓度，由此可知茯苓三萜对酪氨酸酶的抑制作用要强于熊果苷的抑制作用。

本次实验从中药茯苓中进行有效成分的提取。本次试验检测的仅是茯苓中茯苓三萜类化合物对酪氨酸酶的抑制作用，本方法仅适用于对茯苓三萜类化合物的祛斑机制的研究。其他中药抑制黑色素的其他机制还有待进一步探讨。

参考文献：

[1] 王海峰. 茯苓的现代研究进展[J]. 社区医学杂志， 2011，9(12)：44-45.

（作者单位：哈尔滨商业大学 黑龙江哈尔滨市 150028）

本文来源：https://www.dy1993.cn/GjG4.html