细菌耐药机制的规范

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细菌耐药已成为一个全球性问题，耐药细菌感染导致病人住院时间延长、费用增加、死亡率增高，同时也给临床医生抗感染治疗带来困难。

目前细菌耐药性发展速度十分惊人，已对人类健康构成严重威胁。检测细菌耐药机理是当今细菌学的一个最重要的课题，也是正确指导临床医生合理使用抗生素的重要依据。在细菌耐药机理的检测方面，包括分子生物学等许多实验方法被广泛应用。但这些方法的技术要求普遍较高，大多数被用于基础研究。真正应用到临床微生物实验室的试验方法，需要规范化和标准化，只有这样我们的实验结果才准确、可靠，才能达到互认的要求。 一、 革兰阳性球菌耐药机制实验室检测项目

（ 1 ） PRSP( 青霉素耐药肺炎链球菌 )（ 2 ） MRS( 甲氧西林耐药葡萄球菌 ) （ 3 ） HLAR( 高水平氨基糖苷类耐药 ) 4 ） VISA / VRSA( 万古霉素耐药金黄色葡萄球菌 ) （ 5 ） VRE( 万古霉素耐药肠球菌 ) （ 6 ）其他耐药机制 二、 甲氧西林耐药葡萄球菌（ MRS ）检测 苯唑西林纸片筛选试验

方法：使用含1μg苯唑西林纸片（而不是甲氧西林或萘夫西林）来检测甲氧西林 / 苯唑西林的耐药性。用直接菌落悬液法制备的接种物（ 0.5 麦氏比浊浓度菌液）接种 MH 琼脂平板， 33 ℃ -35 ℃ 孵育 24h ，测量抑菌圈直径。 结果判断：按 NCCLS / CLSI 解释标准判断结果，金黄色葡萄球菌和路邓葡萄球菌抑菌圈直径≤ 10mm 为耐药，≥ 13mm 为敏感。除路邓葡萄球菌外的凝固酶阴性葡萄球菌抑菌圈直径≤ 17mm 为耐药，≥ 18mm 为敏感。同时在…透射光 下仔细观察苯唑西林纸片周围抑菌圈内有无细小菌落或轻微弥漫生长，如有说明耐药。

纸片扩散法结果如 有疑问 ，必须进行 mecA 基因或 PBP2a 测定、头孢西丁纸片试验、苯唑西林 MIC 试验或苯唑西林盐琼脂筛选试验，来确定是否为 MRS 菌株， 选择其中一种试验结果 进行报告。

2.苯唑西林-盐琼脂筛选试验

试验用的 MH 琼脂中含苯唑西林6 μ g/ml，并添加有氯化钠（ 4% W/V--0.68 mol/L ）。进行试验时，对琼脂平板可进行 “ 点 ” 种或者用棉拭子蘸取相当于 0.5 麦氏比浊标准的菌悬液进行 “ 划线 ” 接种。将琼脂平板置于 35 ℃ ，孵育 24 小时后检查有无细菌生长， 任何生长 都表示对苯唑西林耐药。

为从凝固酶阴性葡萄球菌中检测出甲氧西林耐药菌株，需要将琼脂平板孵育 48 小时 。 头孢西丁纸片法 方法：应用标准的纸片扩散法试验条件接种 MH 琼脂平板，使用含…30 μ g 头孢西丁 纸片， 35 ℃ 孵育 24h （如耐药则在孵育 18h 后可报告结果）。使用…反射光 阅读头孢西丁纸片试验结果。

结果判读： 头孢西丁对金黄色葡萄球菌和路邓葡萄球菌抑菌圈直径≤ 21mm 时，应报告对苯唑西林耐药，≥ 22mm 应报告对苯唑西林敏感。除路邓葡萄球菌外凝固酶阴性葡萄球菌抑菌圈直径≤ 24mm 时，应报告对苯唑西林耐药，≥ 25mm 应报告对苯唑西林敏感。

检测凝固酶阴性葡萄球菌对苯唑西林的耐药性，头孢西丁纸片试验是…首选方法 （头孢西丁较苯唑西林的敏感性高）。

4. mecA 基因或 PBP 2a 测定

可采用乳胶凝集或分子生物学等方法进行检测（有成品试剂供应）。 检测 mecA 基因和其表达的青霉素结合蛋白 2a (PBP 2a ，也称为 PBP2') 是预报对苯唑西林耐药…最准确 的方法，携带 mecA 基因或产 PBP 2a （ mecA 基因表达产物）的葡萄球菌分离株，应报告对苯唑西林…耐药 。不携带mecA 或不产 PBP 2a 菌株应报告对苯唑西林 敏感 。 5.苯唑西林MIC试验

可采用琼脂或肉汤稀释法或 Etest 等方法进行检测。

若苯唑西林 MIC ≥ 4 μ g/ml ，即使mecA基因和PBP 2a检测为阴性，也应报苯唑西林耐药（罕见非 mecA 基因介导的苯唑西林耐药机制 ）。可同时用纸片扩散法检测这些菌株对头孢西丁的敏感性。

6. MRS的临床报告：对于甲氧西林耐药的葡萄球菌，应报告对所有β内酰胺类药物 耐药，而不考虑这些药物的体外试验结果是否敏感。

万古霉素耐药葡萄球菌的筛选包括三种方法，纸片筛选法，琼脂筛选法以及 MIC 确认试验。 三、万古霉素耐药葡萄球菌的筛选


1.纸片筛选法

应用标准的纸片扩散法试验条件接种 MH 琼脂平板，使用含30μg万古霉素 纸片， 35 ℃ 孵育 24h 。所有抑菌圈 ( 对万古霉素 ) ≤ 14mm 的葡萄球菌均应用稀释法测其 MIC 值，纸片扩散法不能区分万古霉素敏感（ MIC 范围 0.5~2 μ g/ml ）和万古霉素敏感性减低的菌株（ MICs 4~8 μ g/ml ）。万古霉素耐药金黄色葡萄球菌（ VRSA ） (MIC ≥ 16 μ g/ml) ，在万古霉素纸片周围仅见轻微生长。 2. 琼脂筛选法

用含 6 μ g/mL 万古霉素 BHI 琼脂 （脑心浸液琼脂）进行筛选试验， 35 ℃ ，孵育 24h, 点种位置出现 1 个以上菌落，推测菌株对万古霉素敏感性减低。用含 6 μ g/ml 万古霉素 BHI 琼脂3. MIC 确认试验

可采用琼脂或肉汤稀释法或 Etest 等方法进行检测。 任何耐万古霉素葡萄球菌应送参考实验室进一步确证。 四、葡萄球菌诱导性对克林霉素耐药检测

1. 耐药机理： 对大环内酯耐药的葡萄球菌可能存在有 结构性 （天然）或 诱导性 对克林霉素的耐药 [ 通过 erm 基因编码的 23S rRNA 甲基化也称为 MLSB （大环内酯、林可和 B 型链阳霉素）耐药 ] ，或只对大环内酯类耐药（由 msrA 基因编码的外排机制） 2. 采用 “D 试验 ” 进行检测

诱导克林霉素耐药性可用纸片相邻试验，即距含 15 μ g 红霉素 纸片边缘 15~ 26mm 处放置含 2 μ g 克林霉素 纸片来进行检测。 35 ℃ 孵育 24h ，克林霉素抑菌环不出现 “ 截平 ” 现象，应报告分离株对其敏感。邻近红霉素纸片侧的克林霉素抑菌环 出现 “ 截平 ” 现象 （称为 “D” 抑菌环），提示存在可诱导的克林霉素耐药，应报告分离株对克林霉素耐药，在报告中应注明 “ 通过诱导克林霉素耐药试验，推测此菌株对克林霉素耐药，克林霉素对某些病人可能仍有效 ” 。

五、青霉素耐药肺炎链球菌的检测 肺炎链球菌的耐药机制

青霉素耐药肺炎链球菌 （ PRSP ） 的耐药机制是肺炎链球菌有 6 种青霉素结合蛋白

（ PBP ）发生改变，改变后使 PBP （ β - 内酰胺类抗生素的作用靶位）与青霉素的结合力下降，因而导致耐药。

2. 纸片扩散法检测

使用含 1 μ g 苯唑西林纸片 而不是青霉素纸片，来检测肺炎链球菌对青霉素的耐药性。 培养基： Mueller-Hinton 琼脂 +5% 羊血（ MHB ） 接种物： 直接菌落悬液法，相当于 0.5 麦氏标准 孵育： 35 ℃ ± 2 ℃ ； 5%CO2 ； 20-24 小时。 结果判断

当苯唑西林抑菌环 ≥ 20mm 时可报告肺炎球菌对青霉素敏感。并同时可报告氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林 / 克拉维酸、头孢克罗、头孢地尼、头孢吡肟、头孢他美、头孢克肟、头孢噻肟、头孢丙烯、头孢曲松、头孢呋辛、头孢泊肟、头孢唑肟、亚胺培南、氯碳头孢和美罗培南敏感而不需要再测定这些药的敏感性。

当苯唑西林的抑菌环 ≤ 19mm 的菌株应当测定青霉素和头孢噻肟或头孢曲松或美洛培南的 MICs, 因为抑菌环≤ 19mm ，可以发生在青霉素耐药、中介或敏感的某些菌株中， 不能仅仅根据苯唑西林的抑菌环≤ 19mm ，就报告对青霉素耐药或中介。 3. 稀释法检测

用 M-H 肉汤同时加 2%-5% 融血的马血做肺炎链球菌的稀释法药敏试验。青霉素的 MIC ≤ 0.06 μ g/ml 为敏感。

六、耐药肠球菌的检测 1. 青霉素 / 氨苄西林耐药性检测

肠球菌对青霉素和氨苄西林耐药是因为产生了低亲和力的青霉素结合蛋白（ PBPs ）， 个别菌株 是产生β - 内酰胺酶。

纸片扩散法药敏试验可准确测定 PBPs 改变的菌株，但对产β - 内酰胺酶的菌株结果不可靠。此类菌株应测β - 内酰胺酶。

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